Mathieu Amalric commence sa carrière dans le cinéma en multipliant les expériences (accessoiriste, régisseur, cantinier...). Il est, entre autres, assistant stagiaire sur le film Au revoir, les enfants, de Louis Malle (1997). Il fait ses débuts de comédien avec Arnaud Desplechin et obtient en 1997 le César du Meilleur espoir masculin pour le film Comment je me suis disputé... (ma vie sexuelle). Il enchaîne ensuite les rôles, avec André Téchiné (Alice et Martin, 1997), Olivier Assayas (Fin août, début septembre, 1998), les frères Larrieu (Un homme, un vrai, 2002).

Il est l'auteur de plusieurs courts-métrages avant de réaliser son premier long-métrage en 1997, Mange ta soupe, suivi en 2001 par Le stade de Wimbledon. En 2003, il réalise La chose publique, présenté à la Quinzaine des Réalisateurs.

Parallèlement, il poursuit sa carrière de comédien. Il retrouve Arnaud Desplechin pour Rois et reines, qui lui vaut le César du Meilleur Acteur en 2005. Il joue aux côtés d'Eric Bana et Matthieu Kassovitz dans Munich de Steven Spielberg (2006), apparaît dans le film de Sofia Coppola Marie-Antoinette (2006) et interprète le rôle principal du film de Julian Schnabel, Le Scaphandre et le Papillon, qui lui vaut un deuxième César du Meilleur acteur en 2008.

Avec son troisième long-métrage, Tournée, il remporte le Prix de la Mise en Scène au Festival de Cannes 2010.